Количественное экспресс-определение D-ДИМЕРА

Справка

Фибриноген – это один из главных белков системы свертывания крови. В результате сворачивания крови тромбин активирует превращение фибриногена в фибриновые мономеры, что ведет к образованию сгустка [1]. Фибриновые сгустки затем расщепляются плазмином, и Д-димер, который является основным и самым маленьким компонентом фибринолиза, высвобождается в кровь. Присутствие Д-димера в крови указывает на различные нарушения системы свертывания крови, в том числе тромбоз глубоких вен (ТГВ), легочную эмболию (ЛЭ) [2, 3] и атеросклероз. Анализ на Д-димер является широко применяемым и простым методом исключения ТГВ и ЛЭ [4], который к тому же не требует наличия дорогого лабораторного оборудования [5, 6]. У здоровых людей концентрация Д-димера менее 400 нг/мл ФЭЕ (фибрин-эквивалентных единиц).

Принцип определения

Количественный скрининговый экспресс-тест для определения Д-димера в цитратной плазме или цельной крови. В тесте используется особая комбинация окрашенного конъюгата мышиных моноклональных антител к Д-димеру и иммобилизованных на мембране тестовой кассеты других поликлональных антител животного происхождения. В зависимости от концентрации Д-димера в тестовой зоне кассеты появляются линии различной интенсивности окраски, что позволяет количественно оценить концентрацию Д-димера в пробе с помощью экспресс-анализатора для иммунохроматографических тестов «Easy Reader» (VEDALAB).

Состав

• Тестовые кассеты — 20
• Одноразовые пластмассовые пипетки — 20
• Разбавитель во флаконе-капельнице, 5 мл — 1
• Инструкция — 1

Стабильность и хранение

• 1. Хранить при температуре от +4 до +30°C в герметичной фабричной упаковке.
• 2. Не замораживать!
• 3. Тест стабилен до истечения срока хранения, указанного на этикетке.

Меры предосторожности

• Данный тест предназначен только для диагностики in vitro и профессионального применения.
• При работе с пробами пользоваться защитной одеждой и одноразовыми перчатками.
• Не принимать пищу, не пить и не курить в помещении, где выполняется работа с пробами.
• При взятии и тестировании проб не прикасаться руками к слизистой оболочке глаз и носа.
• Внимательно прочитать инструкцию перед проведением теста.
• Не использовать тестовую кассету, если её защитная упаковка повреждена.
• Не использовать тестовую кассету с истекшим сроком хранения.
• Пробы цельной крови следует тестировать сразу после взятия (в течение 4 часов).
• Если тестируются пробы плазмы, то допускается анализ только цитратной плазмы.

Обезвреживание отходов

Все пробы следует считать потенциально инфекционными. После завершения процедуры тестирования утилизировать пробы следует с осторожностью и только после стерилизации в автоклаве или обработки 0,5 – 1% раствором гипохлорита натрия не менее 1 часа.

Подготовка реагента

• Все реагенты готовы к использованию.
• Исследуемые пробы
• Плазма (цитрат) или цельная кровь.
• Взятие и подготовка проб
• Тест предназначен для тестирования цельной крови или цитратной плазмы человека.
• Сбор проб осуществляется с помощью стандартной лабораторной процедуры (асептическим способом, исключающим гемолиз).
• Для теста пригодны только пробы плазмы, полученные с использованием цитрата.
• Каждая проба должна рассматриваться как потенциально инфекционный материал.
• Пробы цельной крови должны тестироваться немедленно (не более 4 часов после получения).
• При тестировании пробы в течение 48 часов после ее взятия крови пробу следует хранить в холодильнике при +2°– +8°C. Если же тест будет выполняться после 48 часов, пробу необходимо заморозить. Замороженные пробы перед тестированием следует оттаять, тщательно перемешать и довести до комнатной температуры. Повторное замораживание проб не допускается.
• В случае мутности, высокой вязкости или наличия в пробе плазмы нерастворимых частиц необходимо перед тестированием развести ее равным объёмом физраствора.

Процедура тестирования

а) Контрольное тестирование

1. Восстановить лиофилизированный контроль и выждать не менее 15 мин до его полного растворения.
2. С помощью лабораторной пипетки с одноразовым наконечником внести 25 мкл контроля в лунку для проб на рабочей кассете. Провести тестирование так же, как и с пробой пациента.
3. Полученный на ридере результат (в нг/мл ФЭЕ) должен находиться в целевом диапазоне значений контроля, указанном на этикетке (целевые диапазоны разных лотов контролей могут немного отличаться).
4. Допускается хранение восстановленного контрольного материала не более суток при +2°– +8°C.

б) Тестирование пробы пациента

1. Довести все пробы и компоненты набора до комнатной температуры.
2. Извлечь тестовую кассету из защитной упаковки, оторвав край упаковки по надрезу.
3. Пометить тестовую кассету фамилией или кодовым номером пациента.
4. Набрать автоматической пипеткой пробу и, держа её строго вертикально, внести 25 мкл цитратной плазмы в лунку для проб тестовой кассеты. Если тестируется цельная кровь, внести в лунку для проб 50 мкл пробы. Подождать, пока проба полностью впитается в адсорбирующую подложку.
5. Внести в лунку для проб по капле 150 мкл (4 полных капли) разбавителя, давая впитываться предыдущей капле.
6. Считать результаты теста (нг/мл ФЭЕ) с помощью прибора «Easy Reader» через 15 минут после внесения пробы.

Более подробное описание работы на приборе смотрите в инструкции к ридеру.

Характеристики теста

a) Линейность

• Диапазон измерения 250-5,000 нг/мл ФЭЕ.
• При концентрации Д-димера ниже 250 нг/мл ФЭЕ результат будет показан как “5,000 ng/mL FEU”.
• Для проб с концентрацией Д-димера выше 5000 нг/мл ФЭЕ необходимо предварительное разбавление физраствором с умножением полученного результата на коэффициент разведения.

б) Точность

Исследование проводилось на пробах с предварительно определенной с помощью анализатора VIDAS (BIOMERIEUX) концентрацией Д-димера, в диапазоне от 250 до 5070 нг/мл ФЭЕ. Концентрация Д-димера вычислялась как линейная функция оптического поглощения:

Y = 0,0571x + 27,07 нг/мл (r = 0,987).

Результаты показали хорошую корреляцию (r > 0.98) между обоими методами.

в) Чувствительность

Пороговая чувствительность теста близка к 200 нг/мл ФЭЕ. При этом результат отражается как «< 250 ng/ml FEU».

Уровни выше 400 нг/мл считаются патологическими.

г) Прецизионность

Панель из 30 проб человеческой плазмы, предварительно протестированных на VIDAS (BIOMERIEUX), исследовались с помощью данного теста. Результаты регистрировались на анализаторе «Easy Reader». Результаты приведены в таблице:

В четырех пробах (выделено жирным шрифтом) наблюдались расхождения с референтным результатом. Для проб №1, 7 и 26 клинический результат был одинаковым (положительный). В пробе №10 параллельно наблюдался высокий уровень СРБ, указывающий на недавно перенесенную инфекцию и возможное присутствие полиспецифических антител, что могло повлиять на иммунодиагностические реагенты (как VEDALAB, так и BIOMERIEUX).

Негативные, пограничные и положительные пробы определялись с помощью данного теста с корреляцией 96,6% по отношению к референтному методу.

д) Хук-эффект (эффект «крюка» для высокой дозы)

При тестировании проб плазмы с концентрациями Д-димера до 10 000 нг/мл ФЭЕ всегда наблюдались положительные результаты. Эффекта высокой дозы не наблюдалось.

Ограничения метода

• Тест полезен в первую очередь как негативный диагностический предиктор. Результат ниже 400 нг/мл ФЭЕ исключает диагноз тромбоза глубоких вен или легочной эмболии.
• Специфичность теста уменьшается с возрастом пациента, а также при некоторых физиологических состояниях. Например, при нормальной беременности концентрация Д-димера в крови возрастает [5]. Т.о., не следует полагаться только на результаты теста у таких пациентов.
• Тест также не следует применять для диагностики ТГВ или ЛЭ у пожилых пациентов (старше 80 лет), у пациентов с подозрением на онкозаболевания, в остром воспалительном состоянии или с острой инфекцией, а также у пациентов с травмами или в послеоперационном периоде. Исследование 255 пациентов, госпитализированных с патологиями, отличными от венозной тромбоэмболической болезни показало, что концентрация Д-димера выше 500 мкг/л (500 нг/мл) наблюдалась у 78% пациентов [8].